OSM significa sintetizador de oligonucleótidos diseñado para su uso en microgravedad, lo que significa que es un dispositivo que fabrica hebras de ADN arbitrarias (de longitud moderada) en el espacio. increíble eh? He estado trabajando en este proyecto durante los últimos ocho meses con un maravilloso equipo de compañeros hackers como parte de la Iniciativa Space Space de Stanford, y me gustaría compartir lo que estamos haciendo, lo que ya hemos hecho, y A donde vamos.
¿Por qué el espacio? Bueno, en primer lugar, el espacio es genial. Pero más seriamente, el acceso al ADN arbitrario en el espacio podría acelerar la investigación en una gran cantidad de campos, y la capacidad de diseñar genéticamente las bacterias para producir sustancias (por ejemplo, en una colonia marciana) podría significar la diferencia entre la muerte y un disparo de salvamento. En resumen, es difícil predecir el ADN exacto que podría necesitar una investigación o uso práctico antes de la mano.
Primero, como Hackaday tiende a ser un poco de luz sobre la terminología de la biología, debemos sacar un poco de vocabulario de la manera de engrasar las formas de comunicación. Si tienes un Ph.D. En la biología sintética, es posible que desee omitir esta sección. De lo contrario, aquí hay cinco términos rápidos que harán que su cerebro sea más grande para que se quede conmigo.
Ácido desoxirribonucleico (ADN)
Dado que el ADN es el foco de este proyecto, es primordial que uno entienda el ADN antes de continuar. Pero, dado que la mayoría ha visto el ADN en los cursos de biología de la escuela secundaria, lo mantendré corto y simple.
Primero, el ADN es un polímero compuesto de nucleótidos. Los nucleótidos son los bloques de construcción del ADN y constan de una de las cuatro nucleobasas: citosina (C), guanina (g), adenina (a), adenina (a) o timina (T), un azúcar llamada desoxirribosa y un grupo de fosfato. Los diferentes nucleótidos pueden unirse intermolecularmente a los nucleótidos correspondientes (A a T; C a G) en una cadena diferente del ADN. Si las bases en una cadena de ADN son los complementos de las bases en otra hebra, los dos polímeros pueden unirse y formar ADN de doble cadena. Y, una nota más: el ADN tiene dos extremos diferentes: un extremo de tres (3 ‘) y un extremo principal de cinco (5’).
Oligonucleótido (AH-LI-GO-NEW-KLEE-O-TIDE)
Los oligonucleótidos son cortos de ADN o moléculas de ARN y son súper útiles en la investigación general, las pruebas genéticas y la bioingeniería. La longitud de un oligo (corta para el oligonucleótido) generalmente se denota como 30-Mer o D30 en el caso de un oligo con 30 bases. ¿Qué tan corto tiene una cadena de ADN para ser considerada un oligo? Bueno, de vuelta cuando estábamos … digamos que no es bueno en la síntesis de ADN, los oligonucleótidos estaban firmemente en el rango de 2-50. Sin embargo, con la llegada de fosforamidita (un método de síntesis de ADN inorgánica), los oligonucleótidos pueden variar de 2 a 1000 + bases de longitud.
Homopolímero
Un oligonucleótido que comprende solo un tipo de base (por ejemplo, AAAAAAA en lugar de AGTCTG) se llama homopolímero.
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TDT)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, comúnmente abreviada a TDT, es una enzima similar a la polimerasa que puede agregar nucleótidos arbitáricos al extremo 3 ‘de una cadena de ADN cuando se cumplen ciertas condiciones. TDT puede agregar los cuatro nucleótidos, pero muestra una preferencia por la guanina (g) y la citosina (C). TDT se puede encontrar naturalmente en células linfoides inmatuales, pre-B y pre-t donde realiza una diversificación genética para nuestros sistemas inmunes al agregar bases al extremo 3 ‘(tres prime primo) de nuestro ADN.
Sybr green i
SYBR (pronunciado como Cyber) es una molécula que se une al ADN formando un complejo de DNA-tinte que absorbe la luz azul y emite luz verde. Además, SYBR se une preferentemente a ADN de doble cadena, pero se unirá a ADN de un solo trenzado en menor medida.
Metas de hacer ADN en el espacio.
Ahora que estamos hablando del mismo idioma, tomemos otra mirada al objetivo de hacer ADN arbitrarios en el espacio enzimáticamente. ¿Qué significa exactamente eso, y por qué el espacio? De acuerdo, vamos a tomar esta palabra por palabra:
Arbitrario: Nuestro proceso no debe simplemente hacer copias de ADN (como PCR), sino que, en su lugar, deben crear cualquier secuencia (por ejemplo, AGCTATC) que se puede escribir en una computadora (y puede existir físicamente).
ADN: Creo que tenían este uno.
En el espacio: Significado obvio: Queremos que nuestro dispositivo final funcione en el espacio, lo que impone todo tipo de restricciones físicas y químicas.
Enzimáticamente: queremos usar un nuevo método de síntesis de ADN utilizando enzimas en lugar del método de fosforamidita intensiva peligrosa y de recursos.
Agregar la capacidad de fabricar el ADN personalizado en la microgravedad puede significar un salto sustancial hacia adelante en nuestra capacidad para sobrevivir lejos de la Tierra. OSM sirve como kit de herramientas de Biohacker por problemas poco fiables, enfrentaremos en nuevos entornos cuando apoyamos la vida en y alrededor de otros planetas.
En resumen, queremos crear oligonucleótidos definibles en el entorno exigente del espacio con un nuevo método a base de enzimá. Dicen que establecen tus metas altas, ¿verdad?
Producto mínimamente viable (MVP)
Está bien, tal vez no sea tan alto. Al menos, no inicialmente. En lugar de saltar en total o nada, hemos elegido tomar un enfoque iterativo. Ahora, estamos trabajando en el lanzamiento de un “producto mínimamente viable” paraAlgunas razones:
Validar nuestro trabajo hasta ahora
Para sentirse cómodo con el diseño listo para el espacio.
Para obtener datos de espacio real
Para ganar credibilidad para futuros lanzamientos.
Proceso MVP
Como este es nuestro producto mínimamente viable, estamos tomando un pequeño mordisco de nuestro objetivo general. Como tal, nuestro MVP sintetizará un homopolímero en el extremo de un oligo existente en lugar de crear ADN completamente arbitrarios. No tendremos un control completo sobre su secuencia (todo a tiempo), pero demostraremos una prueba de concepto de parte de nuestro trabajo.
Primero, comenzaremos con homopolímero adenina (a) hebras de ADN en solución. Una vez en el espacio, elevaremos la temperatura y permitiremos que TDT agregue Thymine (t) a las hebras.
Debido a que la timina (T) y la adenina (a) son complementarias, el ADN de cadena simple debe formar ADN de doble cadena.
Luego, usaremos Sybr Green I para descubrir si hay ADN de doble cadena en solución, para determinar si nuestro experimento funcionó. Esto funciona porque SYRR se une preferentemente al ADN de doble cadena, y solo fluoresces si se unen al ADN. Este paso de verificación es increíblemente importante porque no seremos invertidos, y la ciencia hecha sin verificación no es realmente ciencia.
Además, el ADN de la horquilla o el emparejamiento de base intramolecular de forma más formal, de bucle de tallo, es algo que se ha generado como un problema posible con este diseño. Si el ADN se une consigo mismo, no puede enlazar con otras hebras. Suena como un problema, ¿verdad? Pero mira de cerca: si el ADN se une consigo mismo. Incluso si formamos horquillas en lugar de un ADN de doble cadena “adecuado”, todavía tendremos ADN de doble cadena, que podemos detectar.
En la revisión, estamos utilizando una enzima cuyo propósito es la diversificación genética con SYBR GREEN i, una molécula comúnmente utilizada para los geles de tinción utilizados en la electroforesis para sintetizar el ADN en el espacio.
Ahora, si bien esto suena simple en la práctica, la biología sintética siempre suena simple. Sin embargo, en mi experiencia de biología, nada es siempre simple. Se necesitan todo tipo de datos para que podamos confiar en que nuestro dispositivo funcionará. Lo que hemos hecho hasta ahora:
Datos de viabilidad de la horquilla
Confirmó que podemos sintetizar homopolímeros con TDT de manera efectiva y confiable con todos los nucleótidos
Determinó la compatibilidad a largo plazo de nuestros reactivos (pueden sentarse juntos durante 2 meses)
Dependencia de temperatura explorada de Sybr Green I
Determinó los niveles en los que podemos descubrir la diferencia entre el ADN de doble cadena y la doble cadena con SYBR GREEN i
Diseño MVP
Visualización de diseño de concepto inicial (haga clic para animación completa 22 MB)
Trabajar con enzimas en el espacio es difícil. TDT requiere específicamente las temperaturas controladas, las soluciones de búfer y un recipiente no metálico, todos sostenidos durante más de un mes en el espacio. Además, necesitamos un sistema de verificación a bordo, lo que significa que necesitaremos filtros frágiles y acceso visual a nuestras muestras.
Nuestro diseño inicial cuenta con una cámara de reacción de 50 μl de PDMS (una cámara de reacción de polímero orgánico bio-segura bio-segura) rodeada por un ecualizador de calor de aluminio calentado por módulos Peltier. Los módulos Peltier actualmente transfieren / absorben su calor a / desde un disipador térmico genérico en lugar de algo más específico de la aplicación, ya que no sabemos cuáles pueden ser nuestras condiciones de lanzamiento. Además, un fotodiodo, filtro y LED abraza la cámara de reacción de PDMS, lo que permite pruebas de fluorescencia para verificar el éxito experimental.
Más allá de MVP
Como nuestro MVP es solo un paso de paso para nuestro objetivo final, hemos estado trabajando en todo tipo de otras cosas. Por ejemplo, estamos trabajando en una electrodía en el dispositivo dieléctrico (consulte la derecha) como un stand-in para dispositivos microfluídicos convencionales comúnmente utilizados en el espacio.
μwet, porque es pequeño y está mojado
También hemos explorado pirosquería y síntesis en perlas magnéticas. Además, hablamos tanto sobre el ADN que hicimos el software de visualización de DNA Bare Bones para facilitar la conversación. (Las imágenes de ADN en este artículo fueron generadas por este software).
Sin embargo, en la medida en que hemos venido, todavía estamos enrojeciendo nuestro diseño y nos encantaría cualquier idea que pueda tener. Específicamente, estamos teniendo problemas para encontrar fabricantes de PCB que tengan un espacio mínimo de Sub 1Mil. Consejos, consejos y conversaciones saludables sobre esto son todas bienvenidas en los comentarios a continuación.